سیکل های PCR

مرحله واسرشت (Denaturation)

در این مرحله دورشته DNA هدف و همچنین پرایمر ها و ساختمان ثانویه آنها از یکدیگر جدا می شوند. برای این مرحله دمای 100 تا 92 درجه سانتی گراد در نظر گرفته می شود.

چنانچه زمان یا دمای کافی برای مرحله واسرشت در نظر گرفته نشود، باز نشدن کامل رشته های DNA باعث کاهش کارایی واکنش می گردد. اگر در مرحله واسرشت دما بسیار و یا زمان طولانی باشد موجب از دست رفتن و غیر فعال شدن مواد موجود در واکنش شده و فعالیت آنزیم را کاهش می دهد  نیمه عمر انزیم Taq در 5/97 درجه سانتی گراد 5 تا 6 دقیقه، در 95 درجه سانتی گراد 40 دقیقه و در 5/92درجه سانتی گراد 130 دقیقه می باشد.

 

مرحله اتصال (Annealing)

 

با کاهش دما از مرحله واسرشت به تدریج مولکول DNA تک رشته ای مکمل های خود را پیدا می کند و با آنها اتصال می یابد. به دلیل اینکه تغییر دما از زیاد به کم انجام می شود ابتدا اتصال اختصاصی اتفاق می افتد و سپس با کاهش بیشتر دما تعداد اتصالات غیر اختصاصی افزایش می یابد هر چه GC پرایمر، غلظت و طول آن بیشتر باشد دما و زمان در نظر گرفته در این مرحله بیشتر خواهد بود که در مورد هر جفت پرایمر و هر سیستم PCR باید به طور اختصاصی محاسبه شود. 

 

مرحله ساخت (Extension)

دمای این مرحله بین 70 تا 72 درجه سانتی گراد در نظر گرفته می شود و زمان مورد نیاز به طول سکانس هدف پایانی معمولا زمان 5 تا10 دقیقه ای برای این مرحله در نظر گرفته می شود که با توجه به کاهش مواد اولیه مثل dNTP و پرایمر در سیکل آخر و احتمال وجود محصولات کوتاه، زمان کافی را برای ساخت کامل زنجیره های مکمل فراهم می سازد.

 

 

تعدادسیکل ها

هنگامی که دیگر پارامتر های یک سستم PCR بهینه شده باشند، تعداد سیکل به مقدار DNA اولیه وابسته خواهد بود. یک پروتکل معمول PCR شامل 25 الی 50 سیکل حرارتی است. بر حسب نمونه و نوع موجودی كه DNA از آن استخراج شده تعداد سیكل ها تنظیم می شود.

 

پدیده پلاتو واژه ای است که در مورد خارج شدن روند سنتز محصولات PCR از حالت تصاعدی اطلاق می شود. در این پدیده با افزایش تعداد سیکل بر خلاف انتظار تئوریک، افزایش محصول نخواهیم داشت. این حالت می تواند بعلت تخریب مواد اولیه و یا کاهش و مصرف آنها و همچنین تجمع مواد مهار کننده حاصل از پلی مریزاسیون نوکلئوتید ها باشد و گاهی رقابت بین سنتز قطعات غیر اختصاصی با قطعه اصلی موجب ایجا پدیده پلاتو می شود. 

نوشته شده در تاریخ شنبه 9 دی 1391    | توسط: مشتاق طالب شاوی الربیعی    | طبقه بندی: آموزش ژنتیک مولکولی،     | نظرات()