اجزای واکنش PCR

 

آنزیم

 

ورود DNA پلی مراز های مقاوم به حرارت در تکنیک PCR یکی از پیشرفت های مهم در هر چه قابل دسترس شدن این روش در آزمایشگاه ها بوده است. DNAپلی مراز Taq و Ampli Taq از پرمصرف ترین انزیم های مقاوم به حرارت در PCR می باشند. Taq از باکتری Termus aquaticus، یک باکتری حرارت دوست استحصال می شود که اولین بار از یک چشمه آب گرم جدا گردید. این انزیم قادر است در درجه حرارت بهینه بین 70 الی 80 درجه سانتی گراد، بین 35 الی 100 نوکلئوتید در ثانیه را پلیمریزه کند. ژن کد کننده آنزیم Taq در باکتری اشریشیا کلی کلون شد و نوع جدیدی از آن به نام Ampli Taq تولید و روانه بازار شد. از لحاظ خصوصیات Ampli Taq کاملا شبیه به Taq بوده و تنها تفاوت آنها نوترکیب بودن Ampli Taq می باشد و عموما Ampli Taq در آزمایشگاهها بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد.

 

آنزیم Vent DNA polymerase از دیگر پلیمرازها ی مقاوم به حرارت است که اولین بار از باکتری Thermococoous Litoralis جدا گردید این باکتری یک ارکی باکتر حرارت دوست است که در اعماق اقیانوس ( و در دمای بالاتر از 98 درجه سانتی گراد ) جداسازی شد. شرکت New England Biolab ژن کد کننده این انزیم را در باکتری اشریشیا کلی کلون کرد. انزیم Vent در برابر حرارت مقاومتر از Taq می باشد  و قادر است محصول PCR حتی بزرگتر از 8 الی 13 Kb را پلیمریزه کند. انزیم Vent دارای خاصیت ذاتی اگزونوکلئازی َ3 به َ5 می باشد. لذا مولکول DNA با انتهای َ3-OH ناجور (به طور نادرست جفت شده) بوسیله این انزیم صحیح می گردند. در نتیجه خاصیت ویراستاری و صحت آن 5 تا 15 برابر بیشتر از DNA پلیمراز Taq می باشد.

 

آنزیم Rfu، یکی دیگر از پلیمراز های مقاوم به حرارت می باشد که از یک ارکی باکتر بنام Pyrococcus Furiosus جدا گردیده است . این انزیم به دلیل داشتن خاصیت اگزونوکلئازی َ3 به َ5 دارای قدرت ویراستاری بالا  و توانایی تصحیح باز ناجور است.

 

جهت بهینه سازی یک واکنش PCR توصیه می شود که غلظت های مختلف انزیم مورد بررسی قرار گیرد. طیف غلظت بین 5/0تا 5 واحد انزیم در 100 میکرولیتر است. باید توجه داشت که انزیم های تولید شده توسط شرکت های مختلف با یکدیگر متفاوت می باشند. بنابرین یک واکنش PCR در مورد انزیم مورد استفاده باید بهینه سازی شود. اگر غلظت های آنزیم مورد استفاده زیاد باشد، قطعات غیر اختصاصی در محصول PCR دیده خواهد شد و چنانچه مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد، محصول مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی شود.

 

بافر PCR

 بافر های متعددی برای PCR قابل دسترس است. معمولترین بافر مورد استفاده برای Taq  و Ampli Taq  که به شکل 10X ارائه می گردند، عبارتند از: Tris –HCl 100 میلی مولار با PH برابر با 3/8  و KCl 500 میلی مولار.

 معمولا نمک KCl یا سولفات آمونیوم در بافر استفاده می کنند. باید توجه داشت که غلظت های نهایی نمک، بیش از 50 میلی مولار مانع فعالیت آنزیم Taq  می شود.

 اجزای بافر PCR مورد استفاده در سایر DNA پلیمراز های مقاوم به حرارت متفاوت است . اکثر تولیدکنندگان ، بافر 10X  را همراه با انزیم مربوطه ارائه می دهند.

 داکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTP)

 

همانطور که در سنتز طبیعی DNA 4 نوکلئوتید مورد استفاده قرار می گیرند، در واکنش PCR نیز 4 نوکلئوتید به فرم (dATP , dTTP  , dCTP , dGTP ) مورد نیاز است. نوکلئوتید ها معمولا به طور جداگانه و یا مخلوط، به صورت تجاری عرضه می شوند. معمولا برای رقیق کردن آنها از آب دو بار تقطیر و یا دیونیزه که قبلا PH آن روی 7 تنظیم شده استفاده می کنند. باید توجه داشت که غلظت برابر هر یک از نوکلئوتید ها مورد استفاده قرار گیرد. در غیر این صورت اشتباه جایگزین کردن ایجاد می شود. و توالی محصول PCR با توالی الگو یا هدف متفاوت خواهد بود. در واکنش PCR معمولا غلظت نهایی مخلوط dNTP برابر 1/0 تا 2/0 میلی مول در نظر گرفته می شود. چنانچه اندازه محصول مورد نظر کوچک و تعداد سیکل PCR برابر و یا کمتر از 30 سیکل باشد می توان از غلظت کمتر dNTP  استفاده کرد. چنانچه مقدار dNTP بیشتر از نیاز واکنش باشد، احتمال تشکیل قطعات غیر اتصاصی وجود دارد. تجمع قطعات غیر اختصاصی مانع تکثیر کافی قطعه مورد نظر شده، اختصاصی بودن واکنش را کاهش می دهد و مصرف مواد اولیه کارایی سیستم را در تکثیر قطعات دچار نقصان می کند. 

می توان انواع نوکلئوتید های تغییر یافته را از طریق بکار بردن انالوگ های dNTP در واکنش PCR  وارد محصول نمود و از این طریق محصولات را آشکار و یا ردیابی کرد.

 

 

یون منیزیم  (Mg++)

 

از مواد بسیار مهم واکنش PCR است که بهتر است برای هر واکنش PCR بهینه شود. غلظت نهایی (Mg++) در مخلوط واکنش می تواند متغییر باشد. معمولا این میزان  mM 5 5/0 است.  بطور معمول ، مقدار کم (Mg++) که به صورت MgCl2 عرضه می شود منجر به محصول کم شده و مقدار اضافه آن منجر به جمع شدن محصول غیر اختصاصی می شود.

 

غلظت یون منیزیم در موارد زیر در نتیجه واکنش دخالت دارد:

-          اتصال پرایمر ها: با افزایش غلظت (Mg++)، قدرت اتصال پرایمر ها افزایش می یابد و دمای اتصال بالاتری نیاز خواهد شد و همچنین تمایل اتصال پرایمر ها به توالی هدف و اتصال غیر اختصاصی آنها با سکانس ها الگو افزایش می یابد. این امر از طریقی سبب افزایش حساسیت واکنش می شود و از طرف دیگر اختصاصی بودن واکنش را می کاهد. تشکیل پرایمر دایمر نیز با افزایش یون منیزیم افزایش می یابد که باعث می گردد پرایمر هایی که به صورت لوپ با خودشان و یا به صورت دوتایی با یکدیگر اتصال یافته اند، به طور غیر اختصاصی تکثیر یابند و تجمعی از قطعات کوچک پدید آورند که این وضعیت موجب خروج مقداری از پرایمر ها از واکنش می گردد.

-          دمای واسرشت یا جداسازی رشته ها DNA: با افزایش غلظت یون منیزیم جدا شدن دو رشته DNA از هم در رو رشته ایی الگو و هم در محصول PCR با تاخیر بیشتری انجام می شود. بنابراین زمان در نظر گرفته شده برای مرحله واسرشت ( دناتوراسیون) باید بیشتر شود.

-          فعالیت انزیم DNAپلیمراز: یون منیزیم، فعالیت پلیمرازی آنزیم را افزایش می دهد. این انزیم جهت فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد (Mg++) نیاز دارد.

-          dNTPs: یون منیزیم با نوکلئوتید ها ترکیب شده و کمپلکس محلولی را تولید می نماید که یک نیاز اساسی جهت ورود و جایگزین شدن آنها در زنجیره DNA  در واکنش PCR است. 

  

 DNA الگو

 

الگو در PCR مولکول RNA  یا DNA تک رشته ای  و یا دو رشته ای است. به طور بالقوه، PCR قادر است با یک کپی از الگو نتیجه بخش باشد. لذا باید مراقبت های شدیدی از نظر آلودگی، در روش های تکثیری اعمال شود. اگر چه PCR قادر است حتی یک مولکول تک را در مقادیر نانوگرم از DNA الگو تکثیر نماید. با این وجود باید تعداد بیشتری از مولکول هدف، موجود باشد. تا جواب های مناسب و ایده آل بدست آید.

 

آغازگر ها (Primer)

 

در واکنش PCR آغازگر ها ( پرایمرها ) در دو طرف توالی هدف اتصال می یابد و امکان شروع فعالیت DNAپلی مراز را فراهم می کنند. بنابراین اولین خصوصیت پرایمر، توالی صحیح آن جهت مکان مورد نظر برای تکثیر است. با در دسترس بودن توالی مورد نظر امکان مشخص نمودن توالی پرایمر فراهم می آید . و سپس باید اندازه آنها را مشخص نمود. بطور معمول پرایمرها ی مورد استفاده بین 20 الی 30 نوکلئوتید دارد که منتج به استفاده از دمای بالا تکثیر شده ( سختی زیاد ) و در عین حال از لحاظ آماری، تعداد محل های چسبیدن برای پرایمر حتی در بزرگترین DNA الگو هم فوق العاده کاهش می یابد. هر قدر پرایمر ها طول بیشتری داشته باشند امکان اتصال آنها کمتر است. اما از طرف دیگر استفاده از پرایمر های طویل، امکان اتصال به خود و یکدیگر را افزایش داده و تشکیل پرایمر دایمر و پلی مریزه شدن آنها را تشدید می کند. و همچنین زمان اتصال آنها به الگو را افزایش می دهد. این پدیده بیشتر هنگامی رخ می دهد که طول در نظر گرفته شده برای پرایمر بیش از 30 باز باشد . تشکیل پرایمر دایمر بویژه در سیکل های اولیه PCR که تجمع آنها زیاد است اتفاق می افتد.

یک پرایمر تا انجایی که ممکن است باید تعداد مساوی از هر 4 باز داشته باشد و مناطق غنی از پلی پورین و پلی پیریمیدین موتیف های تکراری نداشته باشد. ترادف پرایمر نباید موجب ایجاد ساختمان ثانویه در آن گردد. پرایمر های پیشرو و معکوس نباید به هم بچسبند. به خصوص در ناحیه َ3 پرایمر ها، نباید توالی های مکمل وجود داشته باشد تا از تشکیل پرایمر دایمر جلوگیری شود.

 

فاصله میان پرایمر ها عموماٌ کمتر از 10 kb است. تکثیر قطعات بیش از kb 3 مشکل و در عین حال میزان بازده سنتز هم پایین است.

 

نوشته شده در تاریخ شنبه 9 دی 1391    | توسط: مشتاق طالب شاوی الربیعی    | طبقه بندی: آموزش ژنتیک مولکولی،     | نظرات()